哺乳动物(wù)细胞培养指南
什么是细胞培养?
细胞培养是指将细胞从动物(wù)或植物(wù)體(tǐ)内取出,然后在适宜的人工环境中生長(cháng)的过程。细胞可(kě)以在培养前直接从组织中取出并通过酶或机械方法进行解离,也可(kě)以来源于已建立的细胞系或细胞株。
原代培养
原代培养的过程指动物(wù)的组织或器官从机體(tǐ)取出后,经机械法或各种酶类(常用(yòng)胰蛋白酶)和鳌合剂(常用(yòng)EDTA)处理(lǐ),使之分(fēn)散成单个细胞,加入适量培养基,置于合适的培养容器中,在无菌、适当温度和一定条件下,使之生存、生長(cháng)和繁殖的过程。
原代培养离體(tǐ)时间短,遗传性状和體(tǐ)内细胞相似,适于做细胞形态、功能(néng)和分(fēn)化等研究。严格地说即从體(tǐ)内取出组织接种培养到第一次传代阶段,但实际上,通常把第一代至第十代以内的培养细胞统称為(wèi)原代细胞培养。一般持续1一4周。此期间细胞呈活跃的移动,可(kě)见细胞分(fēn)裂,但不旺盛。
细胞系
正常的哺乳动物(wù)细胞具有(yǒu)下列四大生物(wù)學(xué)特性:
锚地依赖性:细胞必须负在固體(tǐ)上或固定的表面才能(néng)生長(cháng)分(fēn)裂;
血清依赖性:细胞必须具有(yǒu)生長(cháng)因子才能(néng)正常生長(cháng);
接触抑制性:细胞与细胞接触后,生長(cháng)便受到抑制;
形态依赖性:细胞成扁平状,并有(yǒu)長(cháng)纤维网状结构;
上述特征使得正常的哺乳动物(wù)细胞在體(tǐ)外培养中,一般只能(néng)存活50代且在培养皿上以平面的形式生長(cháng),即单层细胞成長(cháng)。而正常细胞因某些特征的改变而越过生理(lǐ)临界点,继续增殖并无限制分(fēn)裂,这种状态称為(wèi)细胞系形成,此时的细胞称為(wèi)细胞系。
培养基
开始工作前,请检查细胞系随附信息,以确定应使用(yòng)的培养基类型、添加剂和建议。
大多(duō)数细胞系可(kě)以使用(yòng) DMEM 培养基或含 10% 胎牛血清(FBS)的 RPMI 培养基进行培养,并且可(kě)以根据需要添加 2 mM 谷氨酰胺和抗生素(见下表)。
使用(yòng) DMEM 培养基的一般示例:
培养基 | 标准量 |
DMEM - 从 500 mL 瓶中取出 50 mL后,添加其它成分(fēn)。 | 450 mL |
10% 胎牛血清(FBS) | 50 mL |
2 mM 谷氨酰胺 | 5 mL |
100 U 青霉素/0.1 mg/mL 链霉素 | 5 mL |
pH值
大多(duō)数正常的哺乳动物(wù)细胞系都能(néng)在pH值為(wèi)7.4的环境中生長(cháng)良好,而且不同细胞株间差异极小(xiǎo)。
CO2
生長(cháng)培养基可(kě)控制培养物(wù)的pH值,為(wèi)培养细胞pH值的变化提供缓冲作用(yòng)。通常,这种缓冲作用(yòng)通过添加有(yǒu)机(例如HEPES)缓冲液或者CO2-HCO3-(碳酸氢盐)缓冲液实现。
培养基的pH值取决于溶解态CO2与HCO3-间的精密平衡,因此,空气中CO2含量的变化会改变培养基的pH值。為(wèi)此,使用(yòng)含CO2-HCO3-缓冲液的培养基时必须使用(yòng)外源性CO2,特别是使用(yòng)开放式培养皿培养细胞或者需要在高浓度条件下进行细胞系培养时。虽然大多(duō)数研究人员通常使用(yòng)的是空气中CO2浓度為(wèi)5-7%培养基,但是4-10%浓度的CO2适用(yòng)于大多(duō)数细胞培养实验。
温度
细胞培养的最佳温度主要取决于分(fēn)离来源的细胞宿主的體(tǐ)温,此外也部分(fēn)受到解剖部位體(tǐ)温差异的影响(例如皮肤温度可(kě)能(néng)低于骨骼肌的温度)。与温度过低相比,细胞培养时温度过高是更為(wèi)严重的问题;因此,往往将培养箱的温度设定為(wèi)略低于最佳温度的温度。
大多(duō)数人类和哺乳动物(wù)细胞系在36°C至37°C下具有(yǒu)最佳生長(cháng)状态。
观察细胞
每天用(yòng)显微镜观察细胞,以监测其健康状况、生長(cháng)速度和融合度(被单层细胞覆盖的表面积的百分(fēn)比)。
贴壁细胞应主要附着在培养瓶底部,呈贴壁形态(取决于细胞系)并在其膜周围折射出光線(xiàn)悬浮细胞应呈圆形形态,并在其膜周围折射出光線(xiàn)。一些悬浮细胞可(kě)能(néng)会结团(可(kě)添加 Pluronic PF68 等解离试剂去除结团)。
含酚红的培养基应為(wèi)粉红色/橙色(培养基颜色可(kě)能(néng)会随CO2环境发生变化)。成像时可(kě)使用(yòng)不含酚红的培养基,避免干扰图像采集。培养基呈淡黄色表示其呈酸性且 pH 值降低,通常与受到污染或细胞不健康有(yǒu)关。
如果出现以下情况,请丢弃细胞:
细胞大量脱落(贴壁细胞系)和/或看起来干瘪并呈颗粒状/深色;
细胞处于静止状态(看起来根本没有(yǒu)生長(cháng));
接种密度可(kě)用(yòng)于确保细胞在某一特定日期适合某项实验,或保留细胞培养物(wù)以备将来使用(yòng)或作為(wèi)备份。悬浮细胞系根据體(tǐ)积进行接种,因此其接种密度以细胞数/mL 為(wèi)计算单位,而贴壁细胞系则根据培养瓶表面积进行接种,因此其接种密度以细胞数/cm2為(wèi)计算单位。不同的细胞系通常需要满足特定的接种密度,因此務(wù)必查看关于所用(yòng)细胞系的指南。
贴壁细胞系分(fēn)板时,可(kě)以使用(yòng)特定的细胞系分(fēn)板比或接种密度(细胞数/cm2):
分(fēn)板比為(wèi) 1:2 时,融合度应达到 70-80%,并可(kě)在 1-2 天内进行实验;
分(fēn)板比為(wèi) 1:5 时,融合度应达到 70-80%,并可(kě)在 2-4 天内进行实验;
分(fēn)板比為(wèi) 1:10 时,融合度应达到 70-80%,并可(kě)在 4-6 天内进行实验;
分(fēn)板比基于培养瓶表面积计算,例如:
分(fēn)裂比為(wèi) 1:3 时,1 x 25 cm2 培养瓶可(kě)以产出 3 x 25 cm2 培养瓶或 1 x 75 cm2
悬浮细胞系应使用(yòng)特定的细胞系接种密度(细胞数/mL)进行维持:
2e5 应在 3-4 天内进行实验;
1e6 应在 1-2 天内进行实验;
如果细胞長(cháng)时间无人看管(例如公共假日或周末),建议使用(yòng)低于正常水平的接种密度/分(fēn)板比。
更换培养基
如果细胞在几天内生長(cháng)良好但尚未融合,则需更换培养基,以补充营养并维持合适的 pH 值。细胞会产生促生長(cháng)因子,这些因子会被分(fēn)泌到培养基中,因此更换一半培养基既能(néng)补充培养基提供的营养也能(néng)保留这些促生長(cháng)因子。
传代培养悬浮细胞系
查看细胞系指南推荐的细胞分(fēn)板比或传代培养细胞密度。
用(yòng)移液管从培养瓶中将所需量的细胞悬液吸移至新(xīn)培养瓶中。
例如:
要达到 1:2 的分(fēn)裂比,需要从 100 mL 细胞悬液中吸出 50 mL。
要达到 1:5 的分(fēn)裂比,需要从 100 mL 细胞悬液中吸出 20 mL。
将所需量的预热细胞培养基加入到新(xīn)培养瓶中。
传代培养需要胰蛋白酶的贴壁细胞系
注意–并非所有(yǒu)细胞都需要胰蛋白酶化,因為(wèi)胰蛋白酶化对某些细胞可(kě)能(néng)是有(yǒu)害的。胰蛋白酶还可(kě)能(néng)会诱使某些膜蛋白暂时内化,因此设计实验时应考虑到这一点。在这些情况下,通常可(kě)轻轻地刮除细胞或使用(yòng)非常温和的消化试剂或采用(yòng)其他(tā)替代方法。
准备就绪后,小(xiǎo)心地将装有(yǒu)所需细胞的培养瓶中的培养基倒入废液罐(盛有(yǒu)约 100 mL 10% 次氯酸钠),注意不要滴落,以免增加污染风险。
利用(yòng)无菌技术,将足量的无菌磷酸盐缓冲液(PBS)倒入/移液至培养瓶中,以洗涤细胞并完全除去残留培养基中的胎牛血清(FBS)。轻轻摇动几次培养瓶,以冲洗细胞,然后小(xiǎo)心地将无菌 PBS 倒回/移液至废液罐中。
必要时可(kě)以重复一到两次(某些细胞系进行胰蛋白酶消化的时间较長(cháng),并且需要多(duō)次冲洗才能(néng)彻底去除残留的 FBS,从而促进胰蛋白酶化)。
用(yòng)移液管加入足量的胰蛋白酶-EDTA溶液,以覆盖培养瓶底部的细胞。
例如:
在 25cm2 培养瓶中,加入约 1 mL 胰蛋白酶- EDTA溶液。
在 75 cm2 培养瓶中,加入约 5 mL 胰蛋白酶-EDTA溶液。
在 175 cm2 培养瓶中,加入约 10 mL 胰蛋白酶-EDTA溶液。
轻轻转动培养瓶,确保胰蛋白酶与所有(yǒu)细胞接触。将培养瓶放入 37 ℃ 培养箱中。不同细胞系的胰蛋白酶化时间不同。為(wèi)了避免因过度胰蛋白酶化而严重破坏细胞,必须每隔几分(fēn)钟进行一次检查。
细胞脱离后(可(kě)能(néng)需要轻轻敲击几下培养瓶),立即向培养瓶中添加一些培养基(培养基中的 FBS 会使胰蛋白酶失活)
按照所需的分(fēn)板比,用(yòng)移液管从该细胞悬液中将所需體(tǐ)积的细胞吸移到新(xīn)培养瓶中。然后向这些培养瓶中添加培养基至所需體(tǐ)积。
例如:
在 25cm2 培养瓶中,加入约 5-10 mL 培养基。
在 75 cm2 培养瓶中,加入约 10-30 mL 培养基。
在 175 cm2 培养瓶中,加入约 40-150 mL 培养基。
放置细胞过夜,使细胞恢复并重新(xīn)贴壁。更换培养基,以彻底清除残留的胰蛋白酶。
请始终用(yòng)70%乙醇擦拭双手和工作區(qū);
将容器、培养瓶、培养板和培养皿放入细胞培养通风橱之前,先用(yòng)70%乙醇擦其外部;
不要直接从试剂瓶或培养瓶中倾倒培养基和试剂;
使用(yòng)无菌玻璃或一次性塑料移液管和移液器操作液體(tǐ)时,每只移液管只能(néng)使用(yòng)一次,以避免交叉污染,无菌移液管到使用(yòng)时才能(néng)打开其包装,移液管应存放在作區(qū)内;
试剂瓶和培养瓶使用(yòng)后应盖上盖子,多(duō)孔板应用(yòng)胶带密封或放入可(kě)重复密封的袋中,以防止微生物(wù)和悬浮污染物(wù)进入;
无菌培养瓶、试剂瓶和培养皿等到使用(yòng)时才能(néng)打开盖子,不得将其开放暴露在境中,使用(yòng)后,应立即盖好盖子;
盖子取下后,必须开口朝下放置在工作台面上;
必须使用(yòng)无菌的玻璃器皿和其他(tā)设备;
进行无菌操作时,不要交谈、唱歌或吹口哨;
尽可(kě)能(néng)快速地进行实验,以降低污染风险;