重组蛋白表达常见异常及解决方案

选择合适的技术路線(xiàn)会让整个实验过程事半功倍，少走弯路，一般来说要遵循几个基本的原则：最根本的一点是要能(néng)满足实验需求，例如研究一个人源蛋白，对其活性或者翻译后修饰要求很(hěn)高，那就首选哺乳动物(wù)表达系统，或者只需要简单 Western Blot 验证，那大肠表达就能(néng)满足需求；二是经济性及时效性，一般来说大肠表达最快、成本也最低，哺乳动物(wù)表达成本较高，时间也较長(cháng)；三是技术熟练度及其他(tā)需要考虑的问题。

一、设计问题

设计问题常出现在新(xīn)手中，常见的几个问题如信号肽未去除、密码子位移等。成熟蛋白一般是不带信号肽的，大肠杆菌本身也缺乏处理(lǐ)信号肽的机制，信号肽本身一般也具有(yǒu)较强的疏水性，带信号肽表达会导致蛋白无活性或大量包涵體(tǐ)等问题，所以一般在原核表达时候会去除信号肽；密码子移码主要容易在选择酶切位点时候出现，比如常见的 Nco I 位点。另外比如稀有(yǒu)密码子可(kě)通密码子优化解决，在蛋白不表达的时候可(kě)以尝试优化一下密码子；序列 GC 含量、蛋白大小(xiǎo)等问题都是在设计时候需要考虑到的问题；纯化标签的选择，促溶标签对后续研究是否有(yǒu)干扰等也需要全面考虑。

二、表达及纯化过程中遇到的问题

1、蛋白不表达

蛋白不表达原因很(hěn)多(duō)，大部分(fēn)情况下可(kě)以从下面的几个方面去调整排除。通常来说原核表达中小(xiǎo)于 10kd、大于 100kd 的蛋白是比较难表达的；质粒构建好后一定要通过测序确认，仔细比对载體(tǐ)序列及插入序列，确保没有(yǒu)移码及突变；检查表达菌株与质粒是否配套，比如Novagen 的 pet 系列载體(tǐ)是 T7 启动子，配套常用(yòng) BL21 及其衍生菌株，Qiagen 的 pQE 系列载體(tǐ)使用(yòng)的是 T5 启动子，需要用(yòng)到 M15 等配套菌株做表达；检查表达条件是否合适，比如诱导型表达是用(yòng)诱导剂还是温度诱导，是否是组成型表达等；培养基的选择，LB 培养基中不表达，换用(yòng)富营养的 TB 培养基可(kě)能(néng)会解决这个问题；也有(yǒu)可(kě)能(néng)是蛋白表达量太低或者是降解快，必要时需要通过 Western Blot 来确认。

2、纯化中常见问题

2.1 包涵體(tǐ)及其复性 

包涵體(tǐ)在原核中及其常见，通常来说是因為(wèi)蛋白不正确折叠形成的，原因很(hěn)多(duō)，可(kě)能(néng)表达过快而来不及折叠，也可(kě)能(néng)是缺少翻译后修饰导致不正确折叠，还可(kě)能(néng)是蛋白本身疏水性强等各种原因，可(kě)以通过降低诱导温度及诱导剂浓度、引入分(fēn)子伴侣共表达、换专用(yòng)感受态等方式来解决，或者包涵體(tǐ)纯化后复性，注意包涵體(tǐ)纯化复性一般是 his 标签蛋白，常用(yòng)变性剂為(wèi)尿素和盐酸胍，其他(tā)纯化标签需要注意是否兼容变性剂。包涵體(tǐ)纯化后的复性是一个世界性难题，并没有(yǒu)一个通用(yòng)解决方案，常用(yòng)的复性手段有(yǒu)稀释复性、透析复性、分(fēn)子筛及离子柱层析等，复性遵循原则：低温、低浓度、小(xiǎo)梯度，添加剂如 PEG8000、精氨酸等在复性中也常用(yòng)到，可(kě)在一定程度上提高复性成功率。

   包涵體(tǐ)
 1：诱导前 ，2：诱导后，3：包涵體(tǐ)，4：上清

2.2 蛋白降解 

降解也是纯化中常见的现象，一般是因為(wèi)细菌本身的蛋白酶引起的，在破胞及后续的操作中保持低温及全程添加蛋白酶抑制剂能(néng)一定程度上解决降解问题；buffer 中加 5-10%甘油也能(néng)起到抑制降解的作用(yòng)；检查蛋白序列，可(kě)参考 pET 手册中的 N 端原则，如果 M 后為(wèi)精氨酸 、赖氨酸、 组氨酸 、苯丙氨酸 、亮氨酸、异亮氨酸、酪氨酸或色氨酸等的话可(kě)能(néng)对蛋白稳定性影响较大，尽量避免；也可(kě)能(néng)是表达提前终止，或者因為(wèi)密码子偏好性问题，可(kě)换用(yòng)其他(tā)感受态如 Rosett、OrigamiB 等尝试；如果真核蛋白翻译后修饰对蛋白稳定性有(yǒu)影响的话需要考虑换用(yòng)真核表达。

2.3 蛋白纯度不高 

纯化过程中洗杂并不是每次都能(néng)很(hěn)完美洗去杂蛋白，特别是Ni 柱纯化的蛋白，通常杂蛋白较多(duō)，需要多(duō)种纯化方式联用(yòng)，比如离子交换、疏水作用(yòng)纯化、分(fēn)子筛等。原核表达纯化蛋白时候很(hěn)多(duō)时候分(fēn)子伴侣会跟目的蛋白一起很(hěn)难分(fēn)离，可(kě)通过离子柱来结合分(fēn)子伴侣蛋白而让目的蛋白直接流过柱子来分(fēn)离，也可(kě)尝试 Ni 亲和层析时候用(yòng)高盐 buffer（eg：2M NaCl），很(hěn)多(duō)时候也能(néng)达到目的；也可(kě)更换表达感受态，降低表达背景，如 plysS 菌株；标签联用(yòng)也能(néng)有(yǒu)效提高纯化纯度，并且很(hěn)大程度上可(kě)以减少工作量，例如先用(yòng) his 标签亲和层析，再用(yòng) flag 标签做二次纯化，因 flag 特异性很(hěn)强，二次纯化能(néng)明显提高蛋白纯度，但因其成本较高，flag 等标签在大规模纯化中不常用(yòng)。

2.4 SDS-PAGE 条带与预测大小(xiǎo)不符

由于蛋白表达后存在多(duō)种状态，電(diàn)荷分(fēn)布可(kě)能(néng)有(yǒu)差异，导致迁移速率有(yǒu)变化，会导致 SDS-PAGE 条带偏移，复性后蛋白与变性蛋白比较容易出现大小(xiǎo)偏移现象，不同的翻译后修饰也会导致条带大小(xiǎo)不一样，比如 Tau 蛋白存在多(duō)种异构體(tǐ)，同时具有(yǒu)较為(wèi)复杂的磷酸化、泛素化、糖基化等等翻译后修饰，所以可(kě)能(néng)会出现多(duō)条条带现像（eg：30-80 kDa），原核表达的 tau 与磷酸化 tau蛋白大小(xiǎo)就有(yǒu)明显差异，必要时候可(kě)通过 WB 验证。

以上只讨论了體(tǐ)外表达中所遇到的一小(xiǎo)部分(fēn)问题，研究过程中遇到问题时需要大量排查、试错工作，特别是在面对一个全新(xīn)蛋白的时候，细心才是成功的关键。